Среда "Лимфокар-2", 60 мл

Представляет собой готовую к использованию среду, в состав которой входят все необходимые вещества для культивирования лимфоцитов цельной крови. Предназначена для культивирования лимфоцитов крови in vitro с целью получения делящихся клеток и последующего анализа метафазных хромосом.

Инструкция Лимфокар-2

Данный продукт имеет Регистрационное Удостоверение. 

Среда «Лимфокар-2» является вспомогательным средством в диагностике возможных патологических нарушений на генетическом уровне. Используется для диагностики in vitro (кариотипирования) - для культивирования лимфоцитов крови in vitro и последующего цитогенетического анализа метафазных хромосом с вычислением митотического индекса.

Анализ осуществляется с помощью микрометода культивирования лимфоцитов периферической крови человека и приготовления препаратов метафазных хромосом. Для анализа используется гепаринизированная кровь.

Среда «Лимфокар-2» представляет собой готовую к использованию бессывороточную среду, в состав которой входят все необходимые вещества для культивирования лимфоцитов цельной крови: смесь неорганических солей, аминокислот, витаминов, глюкозы, фенолового красного, антибиотиков, а также ФГА-П и др.

Наличие в среде фитогемагглютинина-П (ФГА-П) в оптимальной для лимфоцитов человека концентрации, обеспечивает митогенный эффект среды.

Остановка митотического деления с последующим накоплением метафазных пластин достигается инкубацией клеток с колхицином. В дальнейшем для проведения цитогенетического анализа клетки переводят в гипотонический раствор хлористого калия, фиксируют смесью метанола с ледяной уксусной кислотой. 

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ:

Перед непосредственным применением среду следует разморозить. Размораживание должно происходить естественным путём в холодильной камере при температуре от +2 до +8°С. Запрещена ускоренная разморозка среды и оттаивание при температуре 37°С. Рекомендуется избегать многократных циклов замораживания-оттаивания.

После размораживания и перемешивания среда представляет собой прозрачную жидкость красно-розового цвета.

1. Приступая к работе, содержимое каждого флакона аккуратно перемешать, путём бережного переворачивания флакона.
2. Вскрытие флакона и последующие манипуляции следует производить в асептических условиях.
3. Для культивирования 0,5 мл крови рекомендуется использовать 7 мл среды.
4. В стерильную ёмкость (флакон, пробирку и т.п.), вместимостью не менее 10 мл, в асептических условиях внести 7 мл среды.
   • Лимфокар-2 кат. №Н11 и №Н212 объёмом 60 и 100 мл необходимо перенести в стерильные ёмкости объёмом не менее 10 мл.
   • Лимфокар-2 кат. №Н10 выпускается в готовом для применения объёме 7 мл формате тест-флакона. Культивирование лимфоцитов производится непосредственно в тест-флаконе без переноса в другие ёмкости.
5. В ёмкость со средой внести 0,5 мл цельной гепаринизированной крови.
6. Стерильные ёмкости с тестируемыми образцами инкубировать в термостате при 37°С в течение 72 часов.
7. Растворить колхицин (0,1 мг/мл) в 5 мл дистиллированной воды. За 1,5 – 2 часа до окончания инкубации остановить деление клеток, путём добавления в каждую ёмкость   с культурой клеток (тест-флакон, пробирку) - по 50 мкл водного раствора колхицина.
8. Через 1,5–2 часа после добавления колхицина ёмкость встряхнуть, и перенести её содержимое  в центрифужную пробирку. Клетки осадить центрифугированием в течение 5-7 мин при 1000-1500 об/мин.
9. Приготовить гипотонический раствор хлористого калия (0,075 М), растворением 0,56 г KCl в 100 мл дистиллированной воды. Раствор подогреть до 37°С. 
10. После центрифугирования супернатант удалить, осадок разбить и в пробирку добавить 10 мл подогретого гипотонического раствора KCl. Хорошо перемешать осадок и поместить пробирку в термостат, инкубировать при 37°С в течение 10-12 мин.

11. Обработанные клетки осадить центрифугированием в течение 5-7 мин при 1000-1500 об/мин.

12. Супернатант  отобрать и удалить, оставляя 0,5-1,0 мл  надосадочной жидкости, и энергичным встряхиванием ресуспендировать клетки.
13. Далее проводится фиксация клеток свежеприготовленной смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1. В пробирку, содержащую суспензию клеток добавить резкой струей фиксирующий раствор (2-3 мл), и довести объём в пробирке до 6-8 мл. Разбить осадок и поставить пробирку в холодильник  на 5-10 минут.
14. Обработанные фиксирующим раствором раствором клетки необходимо центрифугировать при 1000-1500  об/мин в течение 5-7 мин. Супернатант удалить, к осадку добавить 8-10 мл охлаждённого фиксирующего раствора. Разбить осадок. Далее выдержать при 4°С в течение 15-20 мин, поместив  в холодильник.
15. Обработанные фиксирующим раствором клетки центрифугировать при 1000-1500  об/мин в течение 5-7 мин. Супернатант удалить. Повторить фиксацию и обработку клеток свежеприготовленной смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 (в пробирку с суспензией клеток добавить фиксирующий раствор (2-3 мл), и довести объём в пробирке до 6-8 мл). Разбить осадок и поставить пробирку в холодильник до окрашивания тестируемых образцов.
16. Обработанные клетки осадить центрифугированием в течение 5-7 мин при 1000-1500 об/мин.  Супернатант удалить. Осадок ресуспендировать в 0,5-1,0 мл фиксирующего раствора и раскапать суспензию на охлажденные, смоченные водой предметные стёкла. Затем с целью фиксации стёкла быстро провести над пламенем горелки или высушить при комнатной температуре.
17. В заключении  препараты подвергают искусственному «старению» и окрашивают, используя краситель Гимза (или другой краситель, с аналогичными характеристиками) по общепринятой методике.

Данная Инструкция разработана на основе рекомендаций по приготовлению хромосомных препаратов (Методическое пособие для врачей «Цитогенетические методы диагностики хромосомных болезней», М. ,2009).

ФОРМА ВЫПУСКА: Препарат выпускают в пластиковых флаконах (ПЭТ-таре) по 7, 60 или 100 мл, которые герметично укупорены. Еврофлаконы имеют широкое, удобное для работы горло.

Срок годности: 2 года.

Срок годности изделия после первичного вскрытия флакона составляет  1 месяц  с даты вскрытия при температуре от +2 до +8°С.

Хранить в защищенном от света месте при температуре от -10 до -20°С.